本文摘自网络，当时出于个人收藏目的，未保存作者名字，现在已无处可查，望原创见谅。
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（一）经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳

这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。含有乙二醛-DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H^＋梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛-DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。
1）在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：
6mol/L乙二醛 5.4μl
DMSO 16.0μl
0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μl
RNA（多达10μl） 5.4μl

市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－20℃。每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。0.1mol/L磷酸钠（pH7.0）的配法如下：将3.9ml 1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L磷酸氢二钠和90ml水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10-20μg细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1％以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加0.5-3.0μg poly(A)+RNA。
2）将微量离心管盖严，将RNA溶液置于50℃温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。
3）于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4％琼脂糖分析1kb以下的RNA样品，而用1％琼脂糖分析1kb以上的RNA样品。用0mmol/L磷酸钠（pH7.0）后，降温至70℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％H₂O₂，于室温放置10分钟后，用经DEPC处理的水彻底冲洗电泳槽。因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭。
4）将RNA样品冷却至0℃，加入4μl灭菌的并经用DEPC处理的戊二醛-DMSO凝胶中样缓冲液，随后立即将上述样品加至凝胶加样孔。用已知大小的乙醛酰RNA作为分子量标准参照物，如用18S和28S rRNA或9S兔β-珠蛋白mRNA，上述RNA长度分别为6322、2366和710个碱基。也可以从BRL购置已知大小的RNA混合物作为分子量标准照物。通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色，可能的话应在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留空一个泳道。
乙二醛-DMSO凝胶加样缓冲液：
50％甘油
10mmol/L磷酸钠（pH7.0）
0.25％溴酚蓝
0.25％二甲苯青FF
5）将凝胶浸入10mmol/L磷酸钠电泳液中，以3-4V/cm电压降进行电泳，同时按图7.1对磷酸钠容液时行持续再循环，使溶液pH值维持在可被接受的限度内（pH>8.0时乙二醛将从PNA分子上解离）。另一方法为电泳时每30分钟换一次磷酸钠缓冲液。
6）电泳结束后（溴酚蓝迁移出区8cm），切下分子量标准参照物的凝胶条，浸入溴化忆锭溶液（0.5μg/ml，用0.1mol/L乙酸铵配制）中染色30-45分钟。在凝胶放置一透明尺，在紫外灯下照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RPN片段大小的lg对数值对RNA条带的迁移距离作图，用所得曲线计算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的RNA分子的大小。
7）RNA从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，将RNA转移至尼龙膜。

（二）将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜

电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法：毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。毛细管洗脱法如下所述，真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必（Thomas，1980）甚至有害（Thomas，1983），但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次，除去甲醛。如果琼脂糖中浓度大于1％或凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氢氧化纳浸泡凝胶20分钟。然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜，RNA随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。
1）将凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝胶的无用部分，在凝胶左上角（加样孔一端为上）切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。
2）用长和宽均大于凝胶的一块Plexiglas有机玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大千烤皿内，上面放一张Whatman 3MM滤纸，倒入20xSSC使液面略低于平台表面，当平上方的3MM滤纸温透后，用玻棒赶出所有的气泡。
3）用一把新的解剖刀或切纸刀裁一张硝酸纤维素滤膜（Schleicher ＆Schuell BA85或与之相当的产品）。滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大1mm，接触滤膜时须戴手套或用平头镊子（例如Millipore镊子），用有油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不易浸温。
4）将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面，直至滤膜从下向上湿透为止，随后用20xSSC浸泡滤膜至少5分钟，用干净的解剖刀片切去滤膜一角，使其与凝胶的切角相对应。不同批号的硝酸纤维膜，其浸湿速率相差悬殊。如滤膜池浮在水面上几分钟后仍未湿透，应另换一张新滤膜，因为未均匀浸湿的滤膜进行RNA转移是靠不住的。这种滤膜也不必丢弃，可将其夹在用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间，高压5分钟。通常上述处理足以使硝酸纤维素滤膜湿透。高压处理的滤膜应夹在经过高压理理并用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间，装入塑料袋，密封后于4℃保存备用。
5）将凝胶翻转后置于平台上温润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶这间不能滞留气泡。
6）用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。并非堆放得十分整齐的纸巾，易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流的短路是导致凝胶中的RNA的转移效率下降的主要原因。
7）在凝胶上方放置温润的硝酸纤维素滤膜，并使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝交之间不应留有气泡。
8）用2xSSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸，温润的放置在湿润的硝酸纤维滤膜上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。
9）切一叠（5－8cm高）略小于3MM滤纸的纸巾，将其放置在3MM滤纸的上方。并在纸巾上方放一块越境玻璃板，然后用－500g的重物压实。其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。
10）使上述RNA转移持续进行6－18小时，每当纸巾浸湿后，应换凝的纸巾。
11）转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于一张干的3MM滤约纸上，用一支极软铅笔或圆珠笔，在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。
12）从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以6xSSC溶液于室温浸泡滤膜5分钟，这一步可以除去粘着在滤膜上的琼脂糖碎片。从6xSSC溶液中取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。于室温晾干30分钟以上。为估计RNA的转移效率，可将胶置于溴化乙锭溶液（0.5μg/ml，以0.1mol/L乙酸铵配制）中染色45分钟，于紫外灯下观察。
13）将晾干的滤膜放在两经张3MM滤纸中间，用真空炉于80℃干烤0.5-2小时。如干烤时间过长，滤膜极易脆裂并可能发黄。如果滤膜并不立即用于杂交实验，可用铝箔宽松地包裹起来，在真空下贮存于室温。
14）仅适用于滤膜上含有乙醛酰PNA的情况：杂交前需用20mmol/L Tris.Cl(pH8.0)于65℃洗膜，除去RNA上的乙二醛分子。

（三）转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的ＲＮＡ染色

当RNA自琼糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜之前，溴化乙锭的染色时间一般不宜过长，这是因为被染料饱和的核酸分子，其转移效率有所降低。然而，用溴化乙锭作短暂染色，既不至于对核酸转移过程产生可以察觉的掏作用，又独具同时检测凝胶和凝膜上的RNA的优点。
１．方法Ｉ
１）电泳结束后，含乙二醛-DMSO的凝胶应浸入含溴化乙锭（0.5μg/ml）的10mmol/L磷酸钠（pH7.0）溶液。甲醛凝胶需用无RNA酶的水淋洗，用20xSSC溶液浸泡，随后用含溴化乙锭（0.5μg/ml）的20xSSC溶液染色。
２）于室温染色5-10分钟，在紫外灯下观察，照像。
３）按前所述方法，将凝胶中的RNA转移至硝酸纤维素滤膜，转移后能常在学光下也可看出已染色的RNA条带。
这种方法仅适用于每一泳道均含有相当大量（如5μg以上）的RNA的情况。
２．方法Ⅱ
硝酸纤维素滤膜上的RNA也可以用下述方法染色：从干烤后的硝酸纤维素滤膜上剪下所需的条带进行染色，也可以用经过杂交并经Ｘ光片曝光后的整张滤膜进行染色（Ａ.Ｅfstratiadis,未了表材料）。
１）将干燥的滤膜浸入５％冰乙酸中，于室温浸泡15分钟。
２）再将滤膜转移至0.5mol/L乙酸钠（pH5.2）、0.04％亚甲蓝溶液中，于室温浸泡5-10分钟。
３）用水淋洗滤膜5-10分钟后，可见RNA分子量标准参照物带型锐利而poly(A)+mRNA为一模糊带型，由许多长度范围从500碱基以下至5kb以上的各种mRNA共同组成，mRNA的平均长度约为2kb。

（四）杂交和放射自显影

固定于滤膜上的RNA的预杂交、杂胶及淋洗等条件，与DNA杂交的相应条件基本相同。现简述如下：

1）用下列两种溶液之一进行预杂交，时间1－2小时。若于42℃进行，应采用。
50％甲酰胺
5xSSPE
2xDenhardt试剂
0.1％SDS
若于68℃进行，应采用：
6xSSC
2xDenhardt试剂
0.1％SDS
2）在预杂交液中加入变性的放射性标记探针，如欲检测低丰度mRNA，所用探针的量至少为0.1μg，其放射性比活度应大于2x10⁸计数/(分·Mg)在适宜的温度条件下继续温育16-24小时。切记RNA只与双链DNA中一条单链互补，因此如用单链探针，则必须是能与RNA互补的一条单链。
3）用1xSSC、0.1％SDS于室温洗漠20分钟，随后用0.2xSSX、0.1％SDS于68℃洗膜3次每次20分钟。
4）用X光片（Kodak XAR-2或与之相当的产品）进行放射自显影，附加增感屏于－17℃曝光24-48小时。

1. Run the gel as normal. Often for genomic southerns it is desirable to run long gels (18cm) over 4-6hrs.

2. Photograph the gel with a ruler adjacent to the molecular weight markers as a reference.

3. Alkali transfer buffer = 0.5M NaOH (20g/lt), 1.5M NaCl (87.66 g/lt). Prepare 1 litre for one gel and another 750ml for each additional gel. BEWARE This buffer is very dangerous, capable of causing severe eye damage. Use the large volumes involved in this procedure with care and wear protective glasses.

4. Add the gel to 250ml alkali transfer buffer, plus 125ml for each additional gel.

5. Place gel on rocker with buffer solution for 20 mins. NOTE low % agarose gels must be agitated slowly to prevent tearing.

6. Keep remaining 500ml for the transfer tank.

Wear gloves for the following steps

7. Cut 2 pieces of large 3MM paper (wicks) and 2 pieces about 2mm smaller than the gel on each edge and one piece of nylon (Hybond N+, Amersham) the same size as the gel.

Large gel (HFI) Medium gel Mini gel

2 (14 x 19 cm) 2 (15.2 x 10) 2 (9 x 5.2)

2 (14 x 32cm) 2 (15.2 x 32) 2 (18.5 x 5.2)

Cut a stack of paper toweling about 2mm smaller than the gel. The stack needs to be about 6cm thick.

8. Prewet nylon in DDW, then soak in alkali transfer buffer.

9. Add buffer to transfer tank to the level of the platform. Wet the long wicks in transfer buffer and place in the tank.

10. Place gel on platform and spoon on transfer buffer. Add the Nylon and smooth out any bubbles with the back of your finger.

11. Add the 2 slightly smaller 3MM filters, the first prewetted, the second dry.

12. Add the stack of paper towels. NOTE it is very important that the edges of the towel do not touch the wicks that the gel is sitting on or the transfer will be " shortcircuited".

13. Top the stack with a glass or plastic plate and a weight (a bottle with about 200-300ml H2O is ideal). Too much weight compresses the gel and terminates the transfer early.

14. Allow to transfer o/n and then remove the stack carefully. Mark the position of the wells on the filter with a biro (and note position of well #1) before removing the filter. Soak the filter in 0.5M Tris pH 7.5, 1.5M NaCl for 5min. after removal from the gel.

15. Add filter to 200ml 2 X SSC and allow to soak without agitation for 5'.

16. Remove filter and blot dry and bake at 80? for 2hr or place in autoclave for 10' when not operating but warm.

17. Prehybridize with 10ml Aqua. hyb. (Reagents), 1% SDS and 100ug/ml boiled herring sperm DNA for 20-30 minutes (cloned DNA southern) to several hrs (genomic southern). 18. Boil probe for 3' and add to 3ml of fresh hyb solution/SDS/Herring DNA. Squeeze prehyb from the bag and add probe. Seal, avoiding air bubbles and distribute the probe well. Incubate for 4-6hr+ (cloned DNA) to 16-20hr (genomic southern). Washes are performed in 2 to 0.2X SSC, 0.1% SDS depending on homology of probe to target.

氨基酸  三字标  一字标  全名
 
丙氨酸  Aln   A  Alanine
精氨酸  Arg  R  Arginine
天冬氨酸  Asn  N  Asparagine
天冬酰胺  Asp  D  Aspardic
半胱氨酸  Cys  C  Cysteine
谷胱酰胺  Glu  E  Gluetamic
谷氨酸  Gln  Q  Gluetamine
甘氨酸  Gly  G  Glycine
组氨酸  His  H  Histidine
异亮氨酸  Ile  I  Isoleucine
亮氨酸  Leu  L  Leucine
赖氨酸  Lys  K  Lysine
蛋氨酸  Met  M  Methionine
苯丙氨酸  Phe  F  Fenylalanine
脯氨酸  Pro  P  Proline
丝氨酸  Ser  S  Serine
苏氨酸  The  T  Threonine
色氨酸  Trp  W  Tryptophan
酪氨酸  Tyr  Y  Tyrosine
缬氨酸  Val  V  Valine

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【材料】
1、LB；2、甘油；3、保存管

【方法】
保藏液体培养基中生长的培养物
1、1.5ml培养物中加0.5ml灭菌的60%甘油[经15psi（1.05kg/cm2）20min灭菌]。
2、用旋涡混合器混合确保甘油分散均匀。
3、将培养物转移到已贴好标签并带有螺盖和空气密封圈的保存管内。
4、将培养物在乙醇-干冰或液氮中冻结，再置-70℃长期保藏。
5、菌种复苏时，用灭菌的接种环刮拭冻结的培养物表面，立即将黏附在接种环上的细菌划在含有适当抗生素的LB琼脂平板表面。将冻结的培养物放回-70℃冻存，平板于37℃培养过夜。从-70℃以下冰箱中取出一份冻存的感受态细菌，于室温慢慢融化，立即放在冰上10min

 

保藏琼指平板上生长的培养物
1、刮下琼脂平板表面生长的细菌。转移至含2mlLB培养基的无菌试管中，再加等体积含30%甘油的LB。
2、用旋涡混合器混合确保甘油分散均匀。
3、将含甘油的培养物分装到带有螺盖和空气密封圈的保存管内，按上述方法冻结。
 

文章出处：医学知识 www.hope.net.cn

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1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）

 

9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。

10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11. 引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
1)避免重复碱基，尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3）GC=30-80%.
4)3\'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。
7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都应该可以的。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。